Polimerāzes ķēdes reakcija
Polimerāzes ķēdes reakcija (PĶR; angļu: Polymerase chain reaction, PCR) ir plaši izmantota metode miljoniem līdz miljardiem konkrēta DNS parauga kopiju (pilnīgas vai daļējas kopijas) izgatavošanai. Tā ļauj zinātniekiem ņemt ļoti mazu DNS paraugu un to (vai tā daļu) pavairot līdz pietiekami lielam daudzumam, lai to varētu detalizēti izpētīt. PĶR 1983. gadā izgudroja amerikāņu bioķīmiķis Kerijs Mulliss (Mullis) uzņēmumā Cetus Corporation, kurš 1993. gadā par šo izgudrojumu saņēma Nobela prēmiju ķīmijā.
PĶR ir būtiska daudzām ģenētiskajā testēšanā un pētniecībā izmantotajām procedūrām, tostarp senu DNS paraugu analīzei un infekciju ierosinātāju identificēšanai. Izmantojot PĶR, ļoti maza daudzuma DNS sekvenču kopijas tiek eksponenciāli pavairotas virknē temperatūras maiņas ciklu. PĶR tagad ir plaši izplatīta un bieži vien neaizstājama metode, ko izmanto medicīnas laboratoriju pētījumos visdažādākajos lietojumos, tostarp biomedicīnas pētījumos un kriminālistikā.[1][2]
Lielākā daļa PĶR metožu balstās uz termisko cikliskumu. Termiskajā cikliskumā reaģenti tiek pakļauti atkārtotiem sildīšanas un atdzesēšanas cikliem, lai notiktu dažādas no temperatūras atkarīgas reakcijas — konkrēti, DNS denaturēšanās un fermentu nodrošināta DNS replikācija. PĶR izmanto divus galvenos reaģentus — praimerus (kas ir īsi vienas virknes DNS fragmenti, pazīstami kā oligonukleotīdi, kas ir mērķa DNS apgabala komplementāra sekvence) un DNS polimerāzi. Pirmajā PĶR posmā abas DNS dubultspirāles virknes fiziski atdala augstā temperatūrā; šo procesu sauc par denaturāciju. Otrajā posmā temperatūra tiek pazemināta, un praimeri saistās ar DNS komplementārajām sekvencēm. Tad abas DNS virknes kļūst par šablonu DNS polimerāzei, lai tā no brīviem nukleotīdiem, kas ir DNS pamatelementi, fermentatīvi saliktu jaunu DNS virkni. PĶR gaitā izveidotā DNS pati tiek izmantota kā šablons replikācijai, izraisot ķēdes reakciju, kurā sākotnējais DNS šablons tiek eksponenciāli pavairots.
Gandrīz visos PĶR lietojumos izmanto termiski stabilu DNS polimerāzi, piemēram, Taq polimerāzi — fermentu, kas sākotnēji izdalīts no termofilās baktērijas Thermus aquaticus. Ja izmantotā polimerāze nebūtu karstumizturīga, tā denaturētos augstās temperatūrās denaturācijas posmā. Pirms Taq polimerāzes izmantošanas katru ciklu DNS polimerāze bija jāpievieno manuāli no jauna, kas bija garlaicīgs un dārgs process.[3]
Šīs metodes pielietojums ietver DNS klonēšanu sekvencēšanai, gēnu klonēšanu un manipulācijas, gēnu mutaģenēzi; uz DNS balstītu filoģenēžu veidošanu vai gēnu funkcionālo analīzi; ģenētisko traucējumu diagnostiku un uzraudzību; seno DNS amplifikāciju; ģenētisko "pirkstu nospiedumu" analīzi DNS profilēšanai (piemēram, kriminālistikā un vecāku izcelsmes noteikšanā); patogēnu noteikšanu nukleīnskābju testos infekcijas slimību diagnostikai.
Atsauces labot šo sadaļu
- ↑ "Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia". Science 230 (4732): 1350–4. December 1985. Bibcode 1985Sci...230.1350S. doi:10.1126/science.2999980. PMID 2999980.
- ↑ "Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase". Science 239 (4839): 487–91. January 1988. Bibcode 1988Sci...239..487S. doi:10.1126/science.239.4839.487. PMID 2448875.
- ↑ Enners, Edward; Porta, Angela R. (2012). "Determining Annealing Temperatures for Polymerase Chain Reaction". The American Biology Teacher 74 (4): 256–260. doi:10.1525/abt.2012.74.4.9.